0.   引 言

癌症是一种高异质性疾病，是在世界范围内对人类健康最大的威胁之一。尽管到目前为止，癌症的治疗已经取得了显著成果，但预计到2040 年，全球癌症病例将达到2840万例^[1]。患者本人承受身心折磨的同时其家庭也将承受巨大的经济压力，恶性肿瘤的治疗与攻克仍是现代社会面临的难题。然而药物研究开发是一个极其复杂、困难和耗资的过程^[2]，目前的研发工作仍然面临着资金投入高、成功率和转化率极低等情况。造成实验失败的原因是多方面的，包括检测方式选择不当、数据质量欠佳、药物效果验证不准确等^[3]。体外培养的细胞系在癌症研究中具有重大的意义，作为简化模型被用于分子和细胞水平的研究，是体外细胞实验不可或缺的实验工具^{[4 − 5]}，细胞模型的出现和使用助力了癌症的研究及药物的研发。

细胞计量是生命科学研究的重要领域，在细胞层面和分子水平都取得了显著的研究成果^[6]，为细胞领域更深层研究打下了稳固的基础。作为首个被成功从患者体内分离并在体外无限培养的癌细胞系-海拉细胞^[7]，由于海拉细胞相比于其他贴壁细胞有较高的耐受性，其被广泛应用于基础性研究^[8]。顺式二氯二氨铂通常称为顺铂，它可以使DNA活性改变，继而诱导细胞凋亡^{[9 − 10]}。由于顺铂的这种抗癌活性，其被选择用于多种恶性肿瘤的治疗,如卵巢癌^{[11 − 12]}和乳腺癌^{[13 − 14]}。本研究选用海拉细胞作为研究对象，顺铂作为实验药物，探究细胞活率的不同检测方式对药物处理结果的影响，为选择合适的药物效果检测方式提供了数据基础。

在使用贴壁的肿瘤细胞进行细胞实验时，经过药物处理，培养基中会存在一定量的漂浮细胞，通常认为漂浮细胞为死亡细胞。然而越来越多的实验证明，经药物处理后贴壁细胞的培养基中存在一定量漂浮的活细胞^[15]。使用不同方法，纳入或不纳入这部分活细胞时，可能对实验结果存在潜在影响。外源性噻唑蓝（MTT)可以被细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原成水不溶性的蓝紫色结晶甲臜并沉积在细胞中，死细胞没有此功能^{[16 − 17]}。2- (2-甲氧基-4-硝苯基)-3- (4-硝苯基)-5- (2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐(WST-8)可以被细胞线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性橙黄色甲臜产物，CCK8法正是基于WST-8的性质而被用于实验中。MTT法和CCK8法常被用来做细胞增殖测定^{[18 − 19]}、细胞毒性测定^{[20 − 21]}、细胞活性测定^{[22 − 24]}和药物筛选^[25]等实验，MTT法要先加入MTT溶液，反应生成沉积在细胞中的不溶于水的蓝紫色甲臜后，吸掉上清并加入二甲基亚砜 (DMSO) 溶液溶解甲臜，用酶联免疫检测仪在570 nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量^{[26 − 27]}。但是上清中含有悬浮的细胞，而悬浮细胞中存在一部分漂浮但没有死亡的细胞，直接丢弃有可能会使实验结果产生误差。这些悬浮并且存活的细胞，可能是具有更强耐药性和抗凋亡能力的细胞，有部分肿瘤干细胞的潜质^{[28 − 30]}。CCK8法有相同的问题，如果在加入CCK8溶液之前换新的培养基，去除的旧培养基中存在悬浮的活细胞，那么得到的检测值可能出现误差，影响实验的准确性。

1.   材料与方法

1.1   设 备

光学显微镜（OLYMPUS CKX53）；细胞计数仪（Counter Star)；酶联免疫检测仪（Thermo Fisher, Spectrophotometer）。

1.2   材 料

Hela细胞（BNCC细胞库，编号338703）；细胞培养96孔板（Nest，701001）；24孔板（Nest，702001）；6孔板（Nest，703001）；100 mm细胞培养皿（Nest，704001）。

1.3   试 剂

RPMI-1640细胞培养基（gibco，8123329）；胎牛血清（四季青，11011-8611）；磷酸盐缓冲液（gibco，8123535）；EDTA-胰蛋白酶（gibco，25200-056）；顺铂（Solarbio, C8470）；CCK8（WJLZ，WJ30025）。

1.4   实验方法

1.4.1   细胞培养

Hela细胞的培养基为添加10%胎牛血清（四季青，11011-8611）、1%双抗溶液和90%RPMI-1640（gibco，8123329）的完全培养基，细胞培养于含有5% CO₂，恒温37 ℃的细胞培养箱中。

1.4.2   CCK8法

CCK8法是基于WST-8 化学反应进行的。WST-8 可以被活细胞内线粒体脱氢酶还原生成橙黄色的产物。活细胞数量越多，生成的产物就越多，颜色也越深。使用酶标仪在450 nm波长处测定OD值，通过OD值计算细胞活率间接评估药物效果。

1.4.3   细胞计数仪（Count Star）计数

细胞计数仪检测前需要对死细胞和活细胞进行染色，所用到的AOPI染液是由吖啶橙（AO）和碘化丙啶（PI）共同组成，其中吖啶橙（AO）是可以通过完整的细胞膜，与细胞核中的DNA结合发出绿色荧光的染料；碘化丙啶（PI）是只能通过不完整的细胞膜与细胞核中DNA结合，发出红色荧光的染料。所以在激发光的激发下，活细胞发绿色荧光而死细胞发红色荧光。细胞悬液与AOPI染液各取10 μL，把两者按1∶1混合均匀，全部转移到Count Star计数板上，并选择AOPI计数模式，每个样品3个重复，每个重复随机选择三个视野拍照自动检测计数。

1.5   统计分析

1.5.1   药物抑制率、用药后细胞活率计算

采用CCK8法时，以CCK8 OD值计算药物抑制率和细胞活率，药物抑制率公式为(OD_对照组-OD_实验组)/OD_对照组 × 100%，用药后细胞活率公式为OD_实验组/OD_对照组 × 100%。采用细胞计数仪计数时，以计量的细胞数量计算用药后细胞活率，公式为实验组活细胞数量/对照组活细胞数量 × 100%。

1.5.2   差异统计分析

实验数据采用Graphpad Prism 9.0 软件进行统计分析。其中两组间的实验数据对比，采用paired t-test进行分析；多组间实验数据对比，则采用Two-Way ANOVA multiple comparison 进行统计分析。*号代表差异显著性，其中*表示P 值< 0.05，**表示P 值< 0.01，***表示P 值< 0.001，****表示 P 值< 0.0001。

2.   实验结果与讨论

2.1   CCK8孵育时间及顺铂处理时间优化

如图1（a）所示，实验首先比较不同浓度顺铂在CCK8不同孵育时间情况下，顺铂反应结果差异。按每孔3000个细胞接种于96孔板中，顺铂浓度为0、1 × 10⁻⁵ μM、1 × 10⁻⁴ μM、1 × 10⁻³ μM、1 × 10⁻² μM、0.01 μM、0.1 μM、1 μM、10 μM、100 μM。当在显微镜下观察到96孔板中的细胞完全贴壁后，加入顺铂。当在显微镜下观察到加入10 μM顺铂的细胞完全死亡后（三天），吸去96孔板中的旧培养基，加入新鲜培养基和CCK8溶液，在37℃细胞培养箱中孵育。在孵育0.5 h、1 h、2 h、4 h后，使用酶联免疫酶标仪，检测各孵育时间点在450 nm处的吸光度值，得到OD值计算出生长抑制率（顺铂抑制率），并使用 Graphpad Prism的dose response inhibition功能log（inhibitor）vs response（three parameters）计算方式得到拟合顺铂抑制率曲线，并且计算出IC50。结果为图1（a）所示，CCK8孵育0.5 h，因为反应时间过短，可能CCK8与活性细胞反应不充分，顺铂反应曲线上各个顺铂浓度的细胞反应率有较大误差（蓝色）。随着孵育时间加长，细胞的生长抑制率与顺铂曲线拟合效果逐渐变好。孵育2 h和4 h，计算出的细胞生长抑制率与顺铂抑制率曲线拟合得最好，两者没有较大差异。图1（a）还显示，顺铂浓度在10、1、0.1 μM时，对细胞有效果，而其他低浓度的顺铂几乎没有效果。所以选用这三种顺铂浓度和2 h孵育时间继续探索合适的顺铂作用时间。图1（b）为不同浓度顺铂对细胞处理1、3、5天的顺铂作用曲线。实验结果表明第3天和第5天的实验数据与顺铂作用曲线拟合效果最好，相比较而言第5天时对照组的细胞生长已经进入了平台期^[31]，得到的实验数据误差较大。顺铂作用3天的IC50为1.239 μM。通过上述优化实验，下一步选用2 h CCK8孵育时间以及3天顺铂作用时间和3天的IC50 (1.239 μM)附近的顺铂浓度，进行下一步实验。

图  1  不同药物浓度和不同CCK8孵育时间下的药物作用

Figure  1.  Drug effects under different drug concentrations and CCK-8 incubation time

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2.2   去除及不去除培养基时顺铂效果的差异

本研究比较了去除以及不去除旧培养基条件下检测到的细胞存活率。通过第一部分实验优化的结果，使用接种3000个细胞/孔的96孔板，选用5 μM、2.5 μM、1.25 μM、0.625 μM顺铂的四个浓度，顺铂作用时长为3天，使用CCK8法作为检测方法，并对两个实验组做去除旧培养基加入新鲜培养基和CCK8（图2 中a）与不去除旧培养基直接加CCK8（图2 中b）的处理。图2操作示意图中的绿色圆点代表活细胞，红色圆点代表死细胞。在细胞染色荧光图片中，绿色荧光（AO）代表活细胞，红色荧光（PI）代表死细胞。图3（a)结果显示，在96孔板中，随着顺铂浓度的降低，去除旧培养基的实验组和不去除旧培养基的实验组细胞存活率都在逐渐提高，而且不去除旧培养基的实验组细胞存活率均比去除培养基的实验组细胞存活率高。顺铂浓度为0.625 μM时，不去除旧培养基的实验组细胞存活率为（83 ±11.651）%，去除旧培养基的实验组细胞存活率为（67 ±6.624）%，两者差异显著。在24孔板中用5 μM、2.5 μM、1.25 μM、0.625 μM顺铂重复这一实验，结果如图3（b）所示，不去除旧培养基的实验组细胞存活率比去除培养基实验组细胞存活率高，两者的细胞活率都随着顺铂浓度降低而增加。顺铂浓度在0.625 μM时，不去除旧培养基的实验组细胞存活率为（94 ±3.687）%, 而去除旧培养基后细胞存活率为（84±4.178）%，两者存在显著差异。

图  2  培养基不同处理方式操作示意图

Figure  2.  Schematic diagram of the operation of different culture medium processing methods

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图  3  去除/不去除旧培养基检测的细胞存活率

Figure  3.  Cell viability assays with or without the removal of old media

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2.3   顺铂处理后培养基中存在漂浮的活细胞

在上述实验的结果中，发现去除旧培养基的实验组细胞存活率要低于不去除旧培养基实验组的细胞存活率，此结果表明加顺铂后的培养基中可能存在漂浮的活细胞，为进一步验证该发现。使用6孔板和100 mm培养皿培养细胞，取0.625 μM和1.25 μM浓度的顺铂对细胞进行处理，使用AOPI染色以及细胞计数仪来测量这两个实验组培养基中悬浮细胞中死细胞、活细胞数量及比率。结果如图4所示，在6孔板和100 mm培养皿中，经由顺铂处理后，培养基中的悬浮细胞都存在一定的活细胞。在6孔板中，对照组活细胞、死细胞个数分别为（2.4 ±1.033）× 10⁴ 、（4 ±0.685）× 10⁴ ；使用顺铂处理后，死细胞比例个数增加，在0.625 μM和1.25 μM中死细胞个数分别为（5 ±0.398） × 10⁴ 、（5.4 ±0.929）× 10⁴（图4（a））。在100 mm培养皿中对照组的活细胞和死细胞个数分别为（2.2 ±0.438）× 10⁵ 、（2.4 ±0.469）× 10⁵，在0.625 μM和1.25 μM中死细胞个数分别为（3.1 ±1.084）× 10⁵ 、（3.8 ±1.089）× 10⁵（图4（b））。

图  4  加药后培养基中的细胞数量

Figure  4.  Number of cells in the medium after drug application

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2.4   顺铂浓度影响培养基中漂浮细胞的活细胞占比

上述统计了在6孔板和100 mm培养皿中，顺铂处理后上层培养基中死细胞和活细胞数量，随即对培养基中漂浮中的活细胞占比进行数据统计。统计结果显示如下，从图5的漂浮细胞中的活细胞占比柱状图可以看出，在6孔板和100 mm培养皿中，在没有进行顺铂处理时，培养基中的漂浮细胞有细胞处于活性状态，漂浮的活细胞在漂浮细胞中的占比分别为（30 ±7.473）%、（45 ±7.071）%。在6孔板中，顺铂浓度为0.625 μM和1.25 μM时，漂浮的活细胞在漂浮细胞的占比分别为（32 ±9.998）%、（37 ±9.860）%，而且1.25μM时的漂浮活细胞的占比要高于0.625 μM时的漂浮活细胞的占比。在100 mm培养皿中，顺铂浓度为0.625 μM和1.25 μM时，漂浮的活细胞在漂浮细胞的占比分别为（42 ±11.790）%、（45 ±3.121）%，和6孔板一样，顺铂浓度为1.25 μM时的漂浮活细胞的占比高于顺铂浓度为0.625 μM时的漂浮活细胞占比。图5 的柱状图还显示，在顺铂处理前和顺铂处理后，100 mm培养皿中漂浮的活细胞在漂浮细胞中的占比均比6孔板中的要高。

图  5  漂浮细胞中的活细胞占比

Figure  5.  Proportion of viable cells among floating cells

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3.   结论

本文研究了经药物处理的细胞检测前旧培养基的不同处理方式对药物实验结果的影响，并探究药物处理后，培养基中是否有漂浮细胞处于活性状态。在进行细胞实验尤其是药物实验时，检测细胞活率以评估药物效果，上层培养基中的悬浮细胞也要纳入检测范围。实验结果表明，加药处理后的上层培养基中存在活细胞。在96孔板和24孔板这种较小容量的细胞培养器皿中进行药物实验，检测时纳入或者不纳入培养基中活细胞时的实验数据存在显著差异，这种差异影响检测得到的活细胞比例，继而使最终药物效果的评估结果产生较大误差，影响后续实验的进行。药物的研发复杂且耗资，因此每一步实验都要相当严谨，注意这些实验细节，有助于实验结果的准确性，促进药物研发的进程。