0.   引言

甲状腺作为人体最大的内分泌腺体，分泌的主要活性物质有三碘代-L-甲状腺原氨酸（T3）和L-甲状腺素（T4）等，它们对于蛋白质合成、体温调节、能量产生和调节有着极为重要的作用^{[1 − 2]}。T3在判断人体生理状况上扮演重要角色，检测血清中T3含量是临床评价和诊断甲状腺功能的重要依据^[3]。根据ISO17511对于体外诊断溯源性的描述^[4]，研究建立完整的溯源体系可以保障临床测量结果溯源至SI国际单位，使得不同实验室间的测量结果具备可比性，从而减少重复测量、减少误差，提高临床诊断效率^{[5- 6]}。

在中国，卫健委临床检验中心于2015年研制并获批了四个表达水平的血清甲状腺素标准物质（GBW09127-GBW09130），在国内填补了基质型甲状腺素标准物质的空白。中国计量科学研究院在2021年研制了T3纯度标准物质（NIM-RM3239），目前正在国家一级标准物质升级过程中，是本文结构类似杂质研究时使用的对象。另外，中国检验检疫研究院也推出了T3冻干粉末国家标准品，其中含有一定量的牛血清白蛋白和磷酸盐缓冲剂，属于基质型物质，其复溶后适用于免疫试剂的校准。国际上，欧洲健康、消费者和参考物质联合研究中心研制了T3纯度标准物质（IRMM-469），其证书中对含量较高的杂质进行了特别标准和说明。美国国家标准与技术研究院（NIST）同样也推出了含有T3成分量值的冰冻孕妇血清标准物质（SRM-1949）。

由此可见，建立我国自有的甲状腺素纯度国家标准物质、填补量值溯源源头的空白、与基质型标准物质形成不间断的溯源链、为体外诊断试剂和临床测量结果提供量值溯源，显得十分紧迫^{[7 − 9]}。T3纯度标准物质（NIM-RM3239）定值过程中采用了定量核磁法和质量平衡法两种绝对定值策略。其中，质量平衡法需要对候选物中结构类似杂质进行分析，通过逐一定值并扣除，获取高准确度的主成分标准值^{[10 − 11]}。由此可见，对结构相关杂质开展分离与分析研究，将进一步提升标准物质标准值的准确性，进而提高下游应用的可靠性^{[12 − 14]}。

本研究首先使用了核磁共振技术，对T3主成分进行了结构确证^{[15 − 16]}。由于T3的合成源头为L-酪氨酸^{[17 − 19]}，一旦其中混有少量的D-酪氨酸，产物将有一定概率生成微量的T3对映异构体（Dextroisomer T3，D-T3）。因此，本文也开发了相应的异构体拆分方法，用于考察和验证T3纯度标准物质中是否含有D-T3。对于其他结构类似杂质，主要采用反相液相色谱串联高分辨质谱的方式进行分析和结构鉴定。结构相关杂质的鉴定结果将用于质量平衡法定值的重要依据，用于T3国家一级标准物质的研制^[20]。

1.   实验部分

1.1   主要仪器与试剂

质谱级纯水，质谱级甲醇，色谱级正己烷，质谱级甲酸，质谱级三氟乙酸采购自美国ThermoFisher公司；NIM-RM3239（CAS：6893-02-3）采购自中国计量科学研究院；氨水（25%）、氘代DMSO采购自Sigma-Aldrich公司；3,3',5-三碘-D-甲状腺原氨酸（D-T3，CAS：5714-08-9）、3',5'-二碘-L-甲状腺原氨酸（CAS：4192-14-7）采购自LGC TRC公司，3,5-二碘-L-甲状腺原氨酸（CAS：1041-01-6）采购自源叶公司，3,3'-二碘-L-甲腺原氨酸（CAS：4604-41-5）采购自上海迈瑞尔公司。

核磁共振仪（AVANCE IIITM 800，德国Bruker 公司）；超高效液相色谱仪（Vanquish，美国ThermoFisher 公司）；液相色谱串联飞行时间质谱仪（Synapt G2，美国Waters公司）；色谱柱：Waters XBridge C18 柱（150 mm × 2.1 mm，3.5 μm），Agilent Poroshell Chiral-CF手性色谱柱（150 mm × 4.6 mm，2.7 μm）。

1.2   样品制备

称取约5.0 mg（精确到0.1 mg）T3粉末于15 mL离心管中，加入10 mL 0.5%氨水溶液涡旋2 min，制备浓度为0.5 mg/mL T3母液；使用移液器吸取100 μL T3母液，与4.9 mL 0.5%氨水混合，得到浓度为10 μg/mL T3工作液，用于结构相关杂质分析。母液、工作液在4℃中保存。

1.3   核磁共振分析

样品处理：称取约10 mg T3标准物质，加600 μL 氘代DMSO溶解，混匀后转移至5 mm 核磁管中，测定该化合物的1H 和13C 核磁共振谱图。

1.4   液相色谱条件

1.4.1   反向分离

基于十八烷基硅烷（C18）固定相（Waters BEH C18）色谱柱，以纯水（含0.1%甲酸，v/v）为A相、甲醇（含0.1%甲酸，v/v）为B相，柱温50℃，流速0.2 mL/min。紫外吸收波长220 nm。优化后有机相梯度在30min内由35%升高至55%。

1.4.2   手性拆分

基于衍生化环果聚糖（CF6）固定相（Agilent Poroshell Chiral-CF）色谱柱，以正己烷（含0.05%三氟乙酸，v/v）为A相、甲醇（含0.05%三氟乙酸，v/v）为B相，柱温40℃，流速0.5 mL/min。紫外吸收波长220 nm。在A相比例40%、70%、90%下开展条件优化，以对映异构体分离程度为流动相优化依据。

1.5   质谱条件

1.5.1   离子源与飞行时间检测器

电喷雾离子源（ESI）为正离子模式，毛细管电压2.5kV，取样电压（Sampling voltage）25V，萃取电压（Extraction voltage）4V，离子源温度100℃，脱溶剂气（氮气）温度300℃，离子源锥孔气（氮气）流速50 L/h，脱溶剂气（氮气）流速300 L/h。

1.5.2   淌度分离条件

Synapt G2离子淌度质谱仪使用氦气作为离子漂移管缓冲气，使用氮气作为淌度分离载气。缓冲氦气流速为90 L/h，载气流速180 L/h，行波波速300 m/s，行波波高40 V。

2.   结果与讨论

2.1   主成分结构鉴定-核磁法

标准物质研制过程中，主成分结构的确认必不可少，通常可采用红外光谱、紫外光谱、核磁共振谱、质谱四种方式进行。本文采用了核磁法和质谱法两种方法对T3主成分进行了结构鉴定。核磁共振可采集到主成分的氢谱（¹H）、碳谱（¹³C），通过原子归属对主成分进行结构确证。质谱定性通常采集主成分质荷比（m/z）,通过与化合物理论值进行对比确认结构的正确性。如图1所示，首先对T3分子中的碳、氢原子进行了位置归属，且化学位移与AIST数据库收录谱图一致，表明该被测物的主成分为T3。

图  1  T3 标准物质在氘代 DMSO 中的核磁共振碳谱与氢谱

Figure  1.  Carbon and proton nuclear magnetic resonance spectra of T3 reference material in deuterated DMSO

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2.2   主成分结构鉴定-质谱法

高分辨质谱分析结果可以直观反映出被测物的质荷比，通过所带电荷数对其分子量进行计算；同时也可以使用二级质谱采集目标物的碎片，从而对其结构进行更为细致的分析。因此，高分辨质谱是公认的高可靠性的化合物定性手段。

图2（A）中保留时间19.4 min的色谱峰对应了T3主成分；根据其同位素峰分布，如图2（B），即651.78和652.78可知，两者相差一个质量数，离子化形式即为[M+H]¹⁺，即分子量的实验值为650.8Da，与T3的理论分子量值一致。

图  2  高效液相色谱串联高分辨质谱分析 T3 标准物质（A） 紫外吸收色谱图；（B）主成分质谱图

Figure  2.  Impurities analysis of T3 reference material using UPLC coupled high-resolution MS. (A) UV spectrometry; (B)Mass spectra of main peak

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2.3   结构类似杂质分布

结构相关杂质通常在合成、纯化等过程中产生，属于工艺杂质，如异构体、聚合体等^{[21 − 22]}；也有一部分是由于保存条件不当而引发，如经常与空气接触而产生的氧化型杂质等。反相色谱分离是最为常用且有效的杂质分析技术。通过优化流动相组成、色谱洗脱梯度、柱温等条件，在弱极性的C18反相色谱作用下，T3标准物质中的主成分与结构相关杂质可发生分离，以不同保留时间按顺序进入后端检测器。

在图2（A）中可观察到主成分附近出现3个具有良好分离度的色谱峰，三者对应的质荷比（m/z）分别为525.89（杂质1，[M+H]¹⁺）、559.86（杂质2，[M+H]¹⁺）、777.69（杂质3，[M+H]¹⁺）。为解析3种结构相关杂质的分子结构，分别开展了二级质谱分析。但需要注意的是，由于杂质相对含量通常较低（每种的面积归一化占比<1%），通常需要增加进样体积或浓度后，才能得到足够强度的一级和二级质谱信号用于结构鉴定。在成倍增加化合物进样量时，需通过六通阀切换的方式，仅允许杂质进入质谱仪，而将含量很高的主成分排出至废液，从而达到保护质谱的目的。在碰撞诱导解离能量（CID）为35V时，获取其子离子质谱图，如图3所示。由图3可知，高质量端（m/z>500）可见各自母离子信号，分别对应了3种杂质(777.7、559.9、525.9)和主成分（651.8）。低质量端（m/z<500）分布了母离子碎裂后的子离子。通过观察发现虽然主成分及杂质组成不同，但碎裂后产生的子离子分布基本一致。结构解析结果表明，低质量端丰度最高的355.1离子对应了T3脱羧、脱碘后离子，这也表明杂质中均含有这一基本单元。对于m/z 777.7和m/z 525.9杂质来说，分别对应了L-甲状腺素（四碘，T4）和二碘甲腺原氨酸。对于m/z 559.9杂质来说，需从原料合成工艺着手。L-酪氨酸在NaI/NaIO₃作用下发生碘化反应，生成3,5-二碘-L-酪氨酸；随后加入乙醇、乙酸酐等对其氨基、羧基进行保护，在自身耦联反应下生成N-乙酰基-3，5-二碘-L-酪氨酸乙酯（中间体），使用盐酸进一步对其进行水解反应，最终获得T3目标物。在这一过程中，盐酸中的氯元素有机会对苯环上的H进行取代，形成氯代甲状腺素。基于此，推断m/z 559.9杂质为氯代二碘甲腺原氨酸，其理论质量与质谱检测结果相一致。最终，杂质的鉴定结果如表1所示。

图  3  主成分及结构类似杂质二级质谱图（A）杂质 3；（B）主成分；（C）杂质 2；（D）杂质 1

Figure  3.  The tandem product ions distribution for main compound and the structural-related impurities (A) Impurity 3; (B)Main compound; (C) Impurity 2; (D) Impurity 1

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表  1  T3纯度标准物质中主要结构近似杂质分布

Table  1.  The main impurities involved in T3 reference material

代号	质荷比	分子式
杂质1	525.89	C15H13I2NO4
杂质2	559.86	C15H11ClI2NO4
杂质3	777.69	C15H11I4NO4

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为了对杂质鉴定结果进行验证，课题组采购了市场中可购买到的相应化合物，但氯代T3（杂质2）目前无法获取。同时，由于杂质1的脱碘位置很难通过二级质谱进行预测，因此将三种形式的脱碘化合物全部进行了分析。如图4所示，根据保留时间和质荷比的信息，最终确定T3标准物质中杂质1为3,5-二碘甲腺原氨酸；在图5中，通过对比杂质3与L-甲状腺素的保留时间与质荷比，其结构鉴定结果也得到了验证。

图  4  杂质1鉴定结果验证:不同脱碘位置的二碘甲腺原氨酸色谱与质谱对比

Figure  4.  Validation of impurity 1 identification: The LC chromatography and MS spectrum comparison between impurity 1 and three kinds of diiodothyroxines

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图  5  杂质3鉴定结果验证: 杂质3与L-甲状腺素色谱与质谱对比

Figure  5.  Validation of impurity 3 identification: the LC chromatography and MS spectrum comparison between impurity 3 and L-Thyronine.

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2.4   对映异构体拆分

对映体具有相同的熔点、沸点、溶解度、折射率、酸性、密度等物理性质，以及热力学性质和化学性质^[23]。但在手性环境（如手性试剂，手性溶剂）中有可能表现出差异，从而进行分离分析^[24]。在临床标志物或药物标准物质研制时，要充分考虑对映体的存在，因为其生物活性通常具有差异，需要格外关注。根据公开的合成路径，L-酪氨酸是T3合成和修饰的源头物质之一。如果源头物质中含有其对映异构体，即D-酪氨酸，那么终产物很可能也具有对映异构体杂质。

本研究中使用了两种方式，对潜在异构体进行了分析和确认。

2.4.1   行波离子淌度质谱分析

离子淌度技术作为一种结构分析技术，拓展了质谱分析的维度。该技术可通过异构体离子不同的碰撞横截面积，在逆向载气作用下发生快速分离，通常在毫秒级范围^[25]。通常来说横截面积相差越大、分离效率越高，因此配有离子淌度功能的质谱也被称为二维质谱，蛋白等大分子有机物成为了离子淌度分析的主要目标^{[26 − 27]}。对于手性异构体^[28]、顺反式异构体^[29]，以及其他小分子有机物，该技术同样具有良好的分析能力。为了验证T3标准物质中是否含有对映异构体，本研究首先采用了Synapt G2自带的行波离子淌度技术，对D-T3进行分析，考察两种对映异构体离子在淌度模块中的漂移情况。如图6所示，虽然离子淌度具有分离速度快、无需衍生化、无需额外配置手性色谱柱等优点，但对于T3来说，在采用不同行波波速情况下（300 m/s、900 m/s、1200 m/s），L-、D-型T3离子均表现出相同的漂移时间（1.84 ms、6.05 ms、3.24 ms），这表明对映异构体无法在行波离子淌度漂移管中发生分离。因此，需要使用其他方法进行对映异构体的拆分。

图  6  L-/D-T3的离子淌度质谱图(A,B)波速300 m/s、波高40v下淌度谱图；(C,D)波速900 m/s、波高40v下淌度谱图；(E,F)波速300 m/s、波高40v下淌度谱图

Figure  6.  Ion mobility spectrometry of L-/D-T3 solution under (A,B)wave velocity 300 m/s, wave height 40v; (C,D)wave velocity 900 m/s, wave height 40v, and (E,F)wave velocity 1200 m/s, wave height 40v, respectively

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2.4.2   衍生化环果聚糖（CF6）色谱分析

手性固定相法,是通过样品与手性选择剂形成非对映体时产生的能量或稳定性差异，从而达到手性分离的方法^[30]，该过程无需通过衍生化反应形成非对映体，属于直接拆分法。目前常用的固定性包含了环糊精类、多糖类、蛋白类等物质^[31]。根据已发表的研究结果可知，多糖类固定性有可能对T3进行有效分离^[32]。本研究采用了固定相为衍生化环果聚糖（CF6）的色谱柱为分离介质，对L、D型T3建立了分析方法。通过优化流动相中正己烷比例，最终实现了T3对映异构体的拆分。如图7所示，当正己烷比例为70%时，等度洗脱下的L-T3（RT=30.42 min）相比于D-T3（RT=32.13 min）具有更短的保留时间。随后以该方法对T3纯度标准物质进行了分析，未发现D-T3的色谱峰。

图  7  基于环果聚糖色谱柱拆分L型、D型T3（A）L-T3基峰色谱图；（B）D-T3基峰色谱图；（C）L-/D-型T3混合样本

Figure  7.  Separation of L-T3 and D-T3 using derivatized cyclofructan liquid chromatography. (A) Base peak ion chromatogram of L-T3;(B) Base peak ion chromatogram of D-T3; (C) Base peak ion chromatogram of L-/D-T3 mixture

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3.   结论

本研究针对三碘代-L-甲状腺原氨酸纯度标准物质建立了核磁、色谱、质谱、离子淌度等分析方法，对其中包含的结构相关杂质进行了分析与验证。核磁共振谱图以及质谱图表明，该标准物质主成分结构正确。根据反相液相色谱分离结果可知，该标准物质中含有3种结构相关杂质，通过多种手段的分析、鉴定、验证，杂质分别被确认为3,5-二碘甲腺原氨酸、氯代二碘甲腺原氨酸、L-甲状腺素，在220 nm紫外波长下3种杂质的相对含量均大于0.1%。为验证是否存在D型T3杂质，本研究同时建立了离子淌度及液相色谱法，对潜在的对映异构体拆进行拆分，结果表明该标准物质中不存在对映异构体。建立结构相似杂质的结构鉴定方法，是T3纯度标准物质研制的关键环节，为质量平衡法赋值提供了可靠依据。