0.   引言

地球上生活着形形色色的生命，它们共同造就了这个多姿而美丽的世界。其中，有一大类微小的“地球居民”被称为微生物，国家科学技术名词审定委员会将其定义为：个体难以用肉眼观察的一切微小生物之统称^[1]。大约70个微生物“肩并肩”排成一行，相当于一根头发丝的宽度^[2]。微生物虽然个头很小但是分布非常广泛，无论是繁华的现代城市、偏僻的乡村田野、还是人迹罕至的高山之巅和神秘莫测的深海之底，到处都有它们的踪迹^[3]。然而，正是这些渺小之极、默默无闻的微生物在地球上做着惊天动地的宏大事业，深远地影响着我们人类的生产生活和周围环境。

自古以来，人类在日常生活和生产实践中，已经觉察到微生物的生命活动及其所发生的作用。早在公元前二千多年的夏禹时期，就有仪狄酿酒的记载，说明当时人们已经开始利用微生物发酵来酿造美酒。在预防医学方面，我国自古就有将水煮沸后饮用的习惯。明朝李时珍在《本草纲目》中指出，将病人的衣服蒸过后再穿就不会传染上疾病，这说明人们已经意识到对微生物消毒可以有效预防传染病。古人在不自觉中利用微生物或者对微生物进行消毒的例子还有很多，但始终没有从科学层面进行解释。

17世纪80年代，荷兰科学家列文虎克用他自制的显微镜在雨水和池塘水等里面发现了许多可以活动的“活的小动物”，这是人类首次观察到微生物。然而，直到19世纪80年代，德国微生物学家罗伯特科赫发明了微生物平板分离纯化技术，并经演变成现如今微生物检测最为常用的平板培养计数方法^[4]，微生物才真正步入了定量时代。在平板培养计数方法问世以来的100多年中，它一直被称为“金标准”方法^[5]，并被广泛地应用于食品安全、临床诊断、生物制药和环境检测等领域，已经与人类的生产生活密不可分。然而，随着科学技术的不断发展，人们逐渐意识到平板培养计数法的诸多局限性，如检测时间较长、不确定度较大、微生物量值无法复测以及该方法仅仅能够培养和检测自然界中的一小部分微生物等^[6-7]。因此，结合计量学进行微生物的精准和快速测量成为计量研究人员紧迫而艰巨的任务。

1.   微生物计量关键技术研究

微生物计量是关于微生物测量及其应用的学科，是基于微生物特性研究其计量单位统一和量值准确可靠的计量学分支。发展微生物计量需要研究建立微生物测量技术和标准物质，实现微生物的特性量值与标称特性在国家和国际范围内的准确一致，保证测量结果最终可溯源到国际SI单位或国际公认单位。因此，微生物计量研究需要解决三个方面的关键技术问题：活性表征、精准测量和快速测量（简称为“活”、“准”和“快”）。在“活”方面主要研究如何表征和保持微生物的生命活性；在“准”方面是研究降低测量不确定度；在“快”方面是研究如何缩短微生物检测时间。通过以上三方面的研究来支撑微生物测量结果可比性、时效性和溯源性。

早在2011年，国际计量局（BIPM）物质的量咨询委员会（CCQM）正式成立了微生物指导专家组（MBSG），当时成员有22人，由美国国家标准与技术研究院（NIST）的Robert Kaarls任第一届主席。2012年在MBSG下设置了微生物定量和微生物定性两个工作组^[8]。2015年国际计量局物质的量委员会将原先的生物分析工作组（BAWG）分成了细胞分析工作组（CAWG）、核酸分析工作组（NAWG）和蛋白质分析工作组（PAWG），并将原先的MBSG合并到CAWG中。2016年又在CAWG内部成立了真核细胞计数、原核细胞计数、血液中血细胞计数3个焦点组（Focus Group）。原核细胞计数焦点组主要以微生物为对象合作研究具有溯源性的微生物测量方法和组织国际计量比对，旨在全球范围内构建微生物测量体系，保证微生物测量结果在国际间的等效一致，实现各国微生物测量结果的国际认可^[9]。从2012年开始至今，MBSG和CAWG先后完成和正在进行的国际微生物计量比对有3项，此外，亚太计量规划组织（APMP）和亚洲标准物质联合研发组织（ACRM）也各有1项微生物计量比对正在进行中，包括了微生物平板计数法比对、微生物流式分析法比对和微生物定性鉴定比对（见表1）。国际上目前从事微生物计量研究的机构主要有美国国家标准与技术研究院（NIST）、德国联邦物理技术研究院（PTB）、欧盟委员会联合研究中心标准物质与测量研究院（JRC-IRMM）和英国国家生物制品检定所（NIBSC）等。由此可见，发达国家和国际区域组织均高度重视微生物计量研究工作，我国也紧跟世界微生物计量发展的脚步，并结合国内产业对微生物测量的需求开展了微生物计量关键技术研究，并开始主导微生物国际计量比对，如表1所示。

表  1  国际微生物计量比对项目

Table  1.  International comparison projects of microbiology metrology

编号	对比内容	主导单位
CCQM1-P205	饮用水中膜完整性大肠杆菌测量比对	中国计量科学研究院
APMP2-QM.P35	饮用水中大肠杆菌的定量测量比对	中国计量科学研究院
ACRM3	奶粉中大肠杆菌活菌标准物质平板计数协同定值比对	中国计量科学研究院
CCQM-Con2	微生物16S rDNA测序比对	美国国家标准与技术研究院
CCQM-PQ01	微生物平板培养计数测量比对	澳大利亚国家计量院
注：1国际计量局物质的量咨询委员会（CCQM）；2亚太计量规划组织（APMP）；3亚洲标准物质联合研发组织（ACRM）。

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1.1   微生物精准测量技术研究

微生物精准测量技术的研究目标是将经典微生物培养计数方法的培养方式转变为菌体标记的非培养方式，将菌落计数和代谢物检测转变为数字信号测量方式，将人工判读计算方式转变为软件自动分析方式，从而大大提升测量精度和节省时间。美国NIST采用库尔特计数法对工程酵母菌标准物质进行定量测量^[10]，德国PTB将流式分析法用于微生物耐药性研究中微生物测量^[11]；中国计量科学研究院采用流式分析法进行细菌活菌定量测量^[12]。

流式分析技术（Flow cytometry）是对生物粒子进行多参数快速定量分析技术，由于微生物比细胞要小将近十倍，所以该技术最早只用于真核细胞检测。经过科研人员不断的对原有技术进行改进，目前流式分析技术可以实现微米级甚至纳米级微生物测量^[13]。因此，流式分析技术以其高通量、多重标记和高精准度等优势成为了微生物精准测量的潜在方法。采用荧光标记抗体特异性识别目标微生物，同时采用膜选择通透性荧光探针（例如：碘化丙啶）表征微生物活性，其原理是碘化丙啶只可以在微生物死亡破裂后进入内部对其核酸进行标记，而当微生物细胞壁结构完整时碘化丙啶无法进入胞内标记核酸，这样就可以有效区分死活菌。将荧光标记后的微生物加入流式分析仪中，微生物随着仪器的液流系统游进去，然后液流系统使微生物一个一个排成长队依次进入检测区，经过激光光源时，微生物就会被激发出特有的荧光而被探测器及时监测到，将数据传输到计算机分析系统对微生物精确计数（如图1所示）。由此可见，融合荧光标记和流式分析技术的微生物测量方法，可实现微生物活菌含量的高特异、多参数测量。

图  1  基于免疫荧光标记和流式分析技术的微生物测量方法原理图

Figure  1.  Schematic diagram of microbiology measurement method based on immunofluorescence and flow cytometry

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目前，中国计量科学研究院已经通过流式分析技术建立了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等多种微生物精准计量方法^{[12, 14]}，该方法主要有以下几个优势：1）精确度高，测量不确定度可从原先大于15%降低到小于5%；2）特异性好，鉴定目标微生物的同时可以有效区分死活菌；3）速度快、实验操作步骤简单，测量时间可以从几天缩短到数小时，最短可达到30分钟以内。

1.2   微生物标准物质研究

由于微生物具有生命活性，当其储存在室温下将因繁殖而数量不断增加，然而当其储存在冷冻状态下又容易因形成冰晶体产生机械性切割效应使得细胞发生破裂而死亡。因此，微生物的测量量值很难在不同实验室之间复现。如何制备生命活性稳定且能均匀分布的微生物标准物质，是长期困扰各国科研工作者的关键难题^[15]。

中国计量科学研究院通过多年的探索，研究建立了一套微生物标准物质制备方法。首先，将微生物培养到对数生长期，使其生理状态达到一致；然后，采用PB（Plackett-Burman）和响应面等实验从上百种试剂中筛选发明出能有效保持微生物活性稳定的保护剂配方；最后，通过冷冻干燥技术将微生物制备成休眠状态，从而实现了微生物量值在不同时间和不同空间的复现^[16-17]。基于自主知识产权的微生物标准物质制备方法，中国计量科学研究院已经成功研制并申报了国家一级标准物质3种和国家二级标准物质15种，主要包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌等（见表2），初步满足了我国在食品安全检测、生物安全防护性能评价、微生物制药和仪器校准等领域微生物的测量需求，使我国成为继欧盟委员会联合研究中心标准物质与测量研究院（JRC-IRMM）、英国国家生物制品检定所（NIBSC）和美国标准与技术研究院（NIST）之后世界上少数几个掌握了微生物标准物质制备技术的国家。

表  2  中国计量科学研究院研制的微生物活菌标准物质

Table  2.  Reference materials of viable microbes developed by National Institute of Metrology, China

标准物质名称	编号	标准值（CFU/mL或CFU/g）	扩展不确定度（CFU/mL或CFU/g，k=2）
枯草芽孢杆菌芽孢计数标准物质	GBW 09858	5.4×108	1.3×108
	GBW 09859	5.2×106	1.3×106
	GBW 09860	5.3×104	1.4×104
粘质沙雷氏菌标准物质	GBW(E)090824	1.07×1010	0.20×1010
奶粉中沙门氏菌计数标准物质	GBW(E)100586	8.1×103	1.2×103
奶粉中阪崎肠杆菌计数标准物质	GBW(E)100585	3.0×103	0.4×103
奶粉中菌落总数标准物质	GBW(E)100590	3.3×103	0.5×103
	GBW(E)100591	3.2×104	0.4×104
	GBW(E)100592	3.2×105	0.4×105
奶粉中金黄色葡萄球菌计数标准物质	GBW(E)100587	2.4×103	0.6×103
	GBW(E)100588	2.4×104	0.6×104
	GBW(E)100589	3.2×105	0.4×105
奶粉中大肠杆菌标准物质	GBW(E)091094	7.8×101	1.3×101
	GBW(E) 091095	5.5×102	1.1×102
	GBW(E) 091096	7.3×103	1.4×103
淀粉中金黄色葡萄球菌标准物质	GBW(E)091091	8.4×102	1.4×102
	GBW(E) 091092	8.7×103	1.4×103
	GBW(E) 091093	4.9×104	0.9×104

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2.   微生物计量的应用

2.1   微生物计量在食品安全中的应用

致病微生物污染是全球性的食品安全问题，特别是国外的食品安全事件大多是由微生物致病菌导致，而我国因很多菜品需要高温加工，大大降低了致病微生物的污染几率。但是，据国家卫生与健康委员会统计数据显示，近10年来食源性致病微生物仍然是引起食源性中毒的主要原因，同时也是我国食品安全的核心问题^[18-19]。目前，中国计量科学院以将微生物精准测量方法应用于食品微生物标准物质制备工艺中，获批了14种食品微生物国家有证标准物质（见表2），现已为国内食品检测机构的质量控制提供了计量支撑。从2019年以来，中国计量科学研究院基于微生物标准物质制备技术承担了国家市场监管总局本级承检机构盲样考核任务，现已开展了奶粉中菌落总数、奶粉中金黄色葡萄球菌、米粉中大肠菌群和蛋粉中沙门氏菌等10多项能力验证项目，并为北京、山东、黑龙江和江苏等省级检测机构提供了上千单元的微生物能力验证样品。通过组织微生物盲样考核和能力验证，中国计量科学研究院帮助食品检测机构查找微生物检测的影响因素，稳步提升了我国食品微生物检测能力和水平。

此外，按照目前国际通用标准，食品中的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7等致病微生物限量检出或不得检出^[20]，依据现行标准微生物的检测需要很长时间。以沙门氏菌为例，传统沙门氏菌检测方法是通过多次培养、形态学鉴定、生化鉴定和血清学鉴定等多达近9个步骤^[21]，耗时近4天以上，因此其检测效率低，时效性差。为提升食品微生物检测效率和缩短检测时间，中国计量科学研究院基于免疫荧光流式分析技术和微生物富集技术研究建立了食品基质中痕量微生物活菌快速灵敏测量方法，将现行标准中数天的检测时间缩短到8小时以内，实现了一个工作日即可完成痕量微生物的检测^[16]。

2.2   微生物计量在生物制药中的应用

微生物计量在生物制药特别是微生物发酵制药领域也有广泛应用前景。微生物发酵不仅可以生产药物例如抗菌素和维生素等，也可以生产功能食品辅料（如辅酶Q10）。但无论生产何种目标产物，微生物发酵过程都是利用其具有代谢活力的活菌作为主体的，所以生产率与有代谢活力的活菌的数量密切相关。在发酵过程中为获得更高的产量就必须精准控制各项参数，其中活菌数量是生物过程优化中最为关键的参数，尤其是活菌浓度与其状态变化分析，可以反映细菌的生长和产物的合成代谢，是整个生物发酵过程研究的核心^[22]。

只有准确测定发酵过程中的活菌数量，才能通过严格控制补料速率来调整微生物密度，从而实现微生物的大规模发酵培养。过去常用的离线测定方法包括平板计数方法、细胞干重方法和吸光度法，都需要把发酵罐打开取样后再进行测定，频繁的采样测定会提高污染杂菌的风险，一旦发酵罐内产品被染菌污染，就要全部倒掉从而造成至少数百万元甚至上千万元的经济损失。目前，人们已经逐步开始采用包括电容法（Electrode method）在内的在线测定方法进行发酵微生物浓度测定，然而由于光密度法和荧光法无法区分死活菌，电极法的优势则逐渐显现。电极法主要原理是活菌具有完整细胞结构可以被极化而死菌不能。因此，在无线电频率范围内，有完整原生质膜的活菌像一个电容器，产生的电容值在一定范围内与活菌浓度成正比（如图2）。但电容法测量活菌量是一种相对测量方法，需要建立电容值和活菌数的标准曲线才能进行准确测量^[23]，因此建立这个标准曲线就显得尤为重要^[24]。

图  2  不同波长下的电容值与活菌浓度的关系

Figure  2.  The relationship between the capacitance and the concentration of viable microbes at different wavelengths

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类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）是微生物发酵应用中主要产辅酶Q10的微生物之一。中国计量科学研究院建立了基于流式分析技术的类球红细菌精准测量方法。采用该方法对系列稀释后的类球红细菌进行定值后与采用电极法测量活菌的结果进行对比发现：在浓度为10⁶～10¹⁰ cells/mL的活细胞体系中，电极法测定的电容值与流式检测结果之间具有良好的线性关系，表明两种检测方法对类球红细菌的活菌计数无显著差异（如图3）。此外，我们初步建立起了类球红细菌的量值溯源传递体系，使得活菌在线检测量值可以通过类球红细菌标准物质进行溯源，并通过国内外比对达到全国甚至全球测量量值统一，可以实现不同时间、不同空间、不同操作人之间的量值复现和一致性。进一步在此基础上结合同位素标记实验研究胞内的代谢途径通量变化优化合成代谢网络，建立了基于在线活菌量定量控制的新工艺，对于辅酶Q10合成速率维持及生产成本降低具有重要意义。以生产辅酶Q10的某企业为例：通过建立基于在线活菌定量测量进行生产质控的新工艺，辅酶Q10产能由原年产量350吨提升至402.5吨，提升了15%。每吨价格按2400元计算，新增产值1.26亿元；每吨利润按700元计算，新增利润3675万元。由此可见微生物计量对于生物制药产业的质量和效益提升发挥了重要作用。

图  3  电容法与流式分析结果之间的线性关系

Figure  3.  Linear relationship between the results of electrode method and flow cytometry

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2.3   微生物计量在生物安全防护性能评价中的应用

生物安全防护装备是高等级生物安全实验室的硬件基础和关键防护屏障，生物安全柜则是生物安全防护装备最主要防护装备之一^[25]，其防护性能的好坏直接关系着实验人员和所处实验环境的安全^[26]。尤其在新冠疫情期间，生物安全柜为医护人员和科研人员从事新冠病毒检测筑起了“第一道防线”，因此其防护性能评价十分重要，一直以来受到了国内外的高度关注^[27]。在生物安全防护装备性能评价方面，中国计量科学研究院经过多年的技术积累和储备，牵头起草了JJF1815-2020《Ⅱ级生物安全柜校准规范》和JJF 1826-2020《空气微生物采样器校准规范》等一系列重要仪器设备计量技术规范。其中JJF1815-2020规范中人员保护、产品保护和交叉污染保护是生物安全柜的关键参数，其性能评价需要使用数量准确的微生物标准物质。中国计量科学研究院采用免疫荧光标记与流式定量分析技术开发了高浓度量值微生物标准物质制备技术，并有效解决了微生物标准物质批次间差异大的难题。基于该技术中国计量科学研究院已经研制出3种不同浓度的枯草芽孢杆菌芽孢计数标准物质（见表2），并成功获批国家一级标准物质，可以确保性能评价指示菌的量值准确、可比、可溯源，为生物安全防护装备性能评价和消毒灭菌效果评价提供了强有力的计量技术支撑和保障。

3.   结论

作为计量科学的重要组成部分之一，微生物计量研究虽然起步较晚但发展非常迅速。历经近十年的不断探索和研究，中国计量科学研究院已经研究建立了微生物精准测量方法和计量标准，并在国际计量局物质的量咨询委员会（CCQM）、亚太计量规划组织（APMP）和亚洲标准物质联合研发组织（ACRM）上积极主导微生物国际对比项目，还与菲律宾、白俄罗斯、泰国、韩国等周边和一带一路沿线国家开展微生物计量的培训和交流，我国微生物计量研究在国际上的影响力已经初步显现。

“微观生命”的神奇和复杂性决定了微生物计量研究将任重而道远，为了应对微生物复杂测量的挑战，满足国家产业和人民生命健康对微生物精准测量的需求，需要不断向微生物计量技术广度和深度进军。未来，我们将继续深入探索研究多维度微生物活性表征技术和建立微生物量值溯源体系，精准揭示微生物与人类和环境相互作用机理；继续加大微生物计量技术成果转化力度，促进我国生物产业的高质量发展；继续积极推动微生物计量国际比对，实现微生物测量量值的全球统一，抢占全球微生物计量研究的制高点。