0.   引言

生化分析是临床诊断常用的重要手段之一，根据样品与试剂发生化学反应是否为固相化学反应，可以将生化分析分为湿式（普通）生化分析和干式生化分析两种^[1]。随着临床对急诊生化检验结果在报告时间上越来越快的要求以及临床生化检验技术的快速发展，急诊生化检验技术逐渐从传统的湿式生化分析向干式生化分析发展^[2]。

干式生化分析仪是一种专门使用固相载体试剂进行临床生化检验的分析仪，利用它通过反射光度法、差示电位法等方法可准确测定样品中特定成分的浓度或活度^[3]。其中反射光度法（包括终点法和速率法）的显色反应发生在固相载体，对透射光和反射光均有明显的散射作用，不遵从朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律，并且固相反应膜的上下界面之间存在多重内反射，服从库贝尔卡-芒克（Kubelka-Munk）理论，或以威廉姆斯-克拉珀（Williams-Clapper）方程予以修正^[4-5]；终点法（End-point Assay）是通过测定酶促反应（化学反应）从开始到反应达到平衡时产物或底物浓度总的变化量，以计算待测物的酶活力的方法（亦称平衡法），如对葡萄糖（GLU）浓度的测定就使用终点法；速率法（Rate Assay）是通过连续测定（每15 s～1 min测量一次）酶促反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间的变化来计算酶促反应速率的方法（亦称连续监测法），如对丙氨酸氨基转移酶（ALT）浓度的测定就使用速率法^[6-7]。差示电位法（Differential Potentiometry）使用固态离子选择性电极，以离子-电子转换层（即固体接触层）替代了内参比电极及内充液，并在其上涂覆聚合物敏感膜，在热力学平衡条件下，离子选择性电极电位与待测溶液中的目标离子活度的关系符合能斯特（Nernst）方程，如对钾离子（K⁺）浓度的测定就使用差示电位法^[8]。

计量溯源能使检测结果溯源到最高级别的参考系统，是保证终端实验室检测结果准确可比、实现标准化的重要途径^[9-10]。对于临床检验设备校准和计量学溯源，CNAS-CL02-A001：2021《医学实验室质量和能力认可准则的应用要求》（等同采用ISO 15189：2012 Medical laboratories-Requirements for quality and competence）的5.3.1.4 条款明确指出：“实验室应制定程序化文件，对直接或间接影响检验结果的设备进行校准，内容包括：记录校准标准的计量学溯源性和设备的可溯源性校准；定期验证要求的测量准确度和测量系统功能”^[11-12]。据统计，干式生化分析仪经常用于夜间测定急诊项目，操作人员多，故障频繁，无人定期保养，质控及定期校准的频率相对比较低。干式生化分析与湿式生化分析的统计结果差异较大，不同实验室间结果的可比性尚需提高，这表明干式生化分析的规范化和标准化急需解决，如何加强干式生化分析的全面质量控制变得尤为迫切和重要^[13]。为顺应临床对急诊生化检验结果稳定性、可靠性的迫切需求，必须进一步提高干式生化分析测试的准确度和精度。

目前国内已有医药行业标准YY/T 0655-2008《干式化学分析仪》^[14]，同时也有同行对干式生化分析仪的校准方法进行了初步研究，但验证时覆盖的方法学既不全面，也没有形成《干式生化分析仪校准规范》^[15-16]。本文结合多年干式生化分析仪校准经验，根据干式生化分析仪方法学的不同采用对应的标准物质，如冰冻人血清中葡萄糖标准物质（终点法）、人血清无机成分电解质标准物质（差示电位法）、人血清基质丙氨酸氨基转移酶活性浓度标准物质（速率法），同时考虑到固相载体试剂含有的磷酸吡哆醛（P5P）对ALT测量结果的影响^[17-18]，制定了《干式生化分析仪校准规范》，以适应国内干式生化分析仪的校准工作，能够有效促进干式生化分析仪量值溯源的规范化和标准化。

1.   材料与方法

1.1   材料

1.1.1   仪器与试剂

1）冰冻人血清中葡萄糖标准物质。GBW（E）090545：GLU标准值为7.02 mmol/L，扩展不确定度U=0.17 mmol/L（k=2）；GBW（E）090546：GLU标准值为15.94 mmol/L，U=0.29 mmol/L（k=2），北京市医疗器械检验研究院生产。

2）人血清无机成分电解质标准物质。GBW（E）090794：K⁺标准值为4.41 mmol/L，扩展不确定度U=0.11 mmol/L（k=2）；GBW（E）090795：K⁺标准值为7.02 mmol/L，扩展不确定度U=0.16 mmol/L （k=2），深圳市凯特生物医疗电子科技有限公司生产。

3）人血清基质丙氨酸氨基转移酶活性浓度标准物质。GBW(E)090352：ALT标准值为52.3 U/L（含P5P），扩展不确定度U=1.3 U/L（k=2）（含P5P）；GBW(E)090353：ALT标准值为106 U/L（含P5P），扩展不确定度U=2.5 U/L（k=2）（含P5P），嘉兴博泰生物科技发展有限公司生产。

4）多项生化校准血清（冻干粉）。批号为997UE/961UE，通过加入去离子水后稀释成5种浓度的线性校准溶液，英国朗道实验诊断有限公司生产。

5）干式生化分析仪。VITROS 4600型号，美国强生奥索临床诊断公司生产；EZ SP-4430型号，日本爱科来株式会社生产。

1.1.2   其他

1）配套体外诊断试剂。

2）实验用去离子水电导率≤1.0 μS/cm；实验用移液器经过计量校准。

1.2   方法

1.2.1   校准方法

校准时应选择国家有证标准物质，校准过程中需要的配套体外诊断试剂、质控品和校准品，应按照说明书要求的条件进行储存并在有效期内使用，干式生化分析仪在正常工作条件下按常规测试程序先行自校准。

1）示值误差。用干式生化分析仪对所选择分析项目标准物质的浓度连续测定3次，按式(1)计算相对示值误差。

式中，B表示相对示值误差，%；M表示标准物质浓度的3次测量结果平均值；T表示标准物质浓度的标准值。

2）重复性。用干式生化分析仪对标准物质或校准品重复测量6次，并根据式(2)计算相对标准偏差RSD以表征重复性。校准时应优先选择标准物质，不可获得时可选择校准品（如多项生化校准血清）。

式中，RSD表示相对标准偏差，%；${x}_{i}$表示第$i$次样品的测量值；$\overline{x}$表示测量平均值；n表示测量次数，n = 6。

3）线性。选用接近测量范围上下限的线性校准溶液（使用标准物质或校准品线性稀释，至少5种浓度），然后将样品依次分别测定3次，取平均值作为测量值，各被分析项目均得到一组不同浓度的测量值y_i。按式(3)计算线性相关系数r以表征线性。

式中，$r$表示线性相关系数；${x}_{i}$表示被分析项目各个浓度水平线性校准溶液的校准值；$\overline{x}$表示被分析项目各个浓度水平线性校准溶液的校准值的平均值；${y}_{i}$表示被分析项目各个浓度水平线性校准溶液的测量值；$\overline{y}$表示被分析项目各个浓度水平线性校准溶液的测量值的平均值；$n$表示被分析项目浓度水平的数目。

1.2.2   统计学处理

根据JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》提供的方法，对GLU、K⁺、ALT示值误差测量结果进行不确定度评定^[19]，不确定度来源主要包括测量重复性、分辨力和标准物质。

测量结果根据计量特性表进行判断，干式生化分析仪的主要计量特性指标如表1所示。

表  1  干式生化分析仪的主要计量特性指标

Table  1.  Main metrological characteristics of dry biochemistry analyzers

计量特性		范围	指标数值
示值误差	GLU		±10%
	K+		±6%
	ALT		±20%
重复性	GLU	5～22 mmol/L	≤5.0%
	K+	2～8 mmol/L	≤2.0%
	ALT	40～60 U/L	≤12%
		100～300 U/L	≤5.0%
线性	GLU	2～25 mmol/L	r≥0.975
	K+	2～12 mmol/L	r≥0.975
	ALT	10～800 U/L	r≥0.975

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2.   结果

在强生VITROS 4600和爱科来EZ SP-4430干式生化分析仪上对校准方法进行验证实验，其中示值误差项目以前3次测量值进行计算，同时对测量结果进行不确定度评定，结果如表2～表5所示。

表  2  强生VITROS 4600示值误差和重复性验证实验结果

Table  2.  Johnson & Johnson VITROS 4600 indication error and repeatability verification experimental results

测量项目	标准值	测量值						平均值	RSD	示值误差	U (k=2)
GLU (mmol/L)	7.02	6.76	6.73	6.64	6.71	6.71	6.68	6.71	0.6%	−4.4%	2.6%
	15.94	14.84	14.66	14.73	14.76	14.81	14.77	14.74	0.4%	−7.5%	1.9%
K+ (mmol/L)	4.41	4.49	4.60	4.54	4.44	4.55	4.51	4.54	1.2%	3.0%	2.9%
	7.02	7.31	7.27	7.23	7.29	7.31	7.27	7.27	0.5%	3.6%	2.4%
ALT (U/L)	52.3 (P5P)	57.0	56.5	56.0	56.0	57.0	56.0	56.5	0.9%	8.0%	2.7%
	106 (P5P)	116.0	115.0	114.0	115.0	117.0	116.0	115.0	0.9%	8.5%	2.6%

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表  3  强生VITROS 4600线性验证实验结果

Table  3.  Johnson & Johnson VITROS 4600 linearity verification experimental results

测量项目		测量结果					线性相关系数
GLU (mmol/L)	xi	22.54	11.27	7.51	5.63	4.51	0.9999
	yi	22.54	11.13	7.39	5.7	4.59
K+ (mmol/L)	xi	9.75	4.87	3.25	2.44	1.95	0.9999
	yi	9.75	4.87	3.16	2.36	1.94
ALT (U/L)	xi	291	145.5	97	72.8	36.4	0.9990
	yi	291	155.7	102.7	74	36

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表  4  爱科来EZ SP-4430示值误差和重复性验证实验结果

Table  4.  ARKRAY EZ SP-4430 indication error and repeatability verification experimental results

测量项目	标准值	测量值						平均值	RSD	示值误差	U(k=2)
GLU (mmol/L)	7.02	6.94	7.01	6.99	7.04	7.05	6.99	6.98	0.6%	−0.6%	2.6%
	15.94	15.86	15.79	15.81	15.81	15.86	15.84	15.82	0.2%	−0.8%	1.9%
K+ (mmol/L)	4.41	4.26	4.28	4.26	4.3	4.26	4.26	4.27	0.4%	−3.3%	2.6%
	7.02	6.88	6.89	6.82	6.86	6.86	6.84	6.86	0.4%	−2.2%	2.4%
ALT (U/L)	52.3 (P5P)	54.0	53.0	53.0	53.0	54.0	53.0	53.3	1.0%	2.0%	2.8%
	106(P5P)	110.0	109.0	111.0	110.0	110.0	111.0	110.0	0.7%	3.8%	2.5%

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通过表2～表5可知，根据JJF 1094-2016《测量仪器特性评定》的要求^[20]，强生VITROS 4600和爱科来EZ SP-4430的GLU和ALT示值误差测量不确定度均满足U≤1/3MPEV（其中U为测量不确定度，MPEV为最大允许误差的绝对值），可忽略测量不确定度的影响，GLU和ALT示值误差的验证结果符合制定的计量特性指标要求；K⁺示值误差最大值的绝对值均满足≤(MPEV-U)，K⁺示值误差的验证结果符合制定的计量特性指标要求；GLU、K⁺、ALT重复性和线性也符合制定的计量特性指标要求。

表  5  爱科来EZ SP-4430线性验证实验结果

Table  5.  ARKRAY EZ SP-4430 linearity verification experimental results

测量项目		测量结果					线性相关系数
GLU (mmol/L)	xi	22.75	11.38	7.58	5.69	4.55	0.9999
	yi	22.75	11.24	7.57	5.49	4.56
K+ (mmol/L)	xi	9.72	4.86	3.24	2.43	1.94	0.9994
	yi	9.72	4.85	3.10	2.35	2.10
ALT (U/L)	xi	281.3	140.7	93.8	70.3	35.2	0.9999
	yi	281.3	138.3	95	71.7	38

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3.   讨论

目前国内干式生化分析仪以进口品牌为主（如强生VITROS 250、VITROS 350、VITROS 4600、VITROS 5600系列，富士NX500、NX700、NX7000系列，爱科来EZ SP-4430，罗氏 Reflotron Plus，雅培300-G等），国产干式生化分析仪（如艾康C100、C300）只在很少一部分基层医院使用。本文研究内容以国内急诊检验常用的2个型号干式生化分析仪为代表示例，覆盖了终点法、速率法和差示电位法等干式生化分析仪所涉及的方法学，在一定程度上能够表明国内干式生化分析仪整体的在用情况。

针对干式生化分析仪的主要计量特性指标，通过对生产厂家和用户的调研，鉴于干式生化分析仪的温控系统多为半封闭和敞开式的结构，且温控系统在生化反应中起辅助作用，同时参考JJG 464-2011 《半自动生化分析仪检定规程》和JJF 1720-2018 《全自动生化分析仪校准规范》未规定温控系统检定校准的做法^[21-22]，选择了示值误差、重复性和线性等指标作为干式生化分析仪的计量特性指标。进行了多次验证实验，其中GLU、K⁺、ALT的重复性，GLU、K⁺、ALT的线性和GLU的示值误差指标是参照YY/T 0655-2008《干式化学分析仪》确定^[14]；K⁺的示值误差指标是参照CLIA’88 Proficiency Testing Regulations Related to Analytes and Acceptable Performance确定^[23]；ALT的示值误差指标是参照JJF 1720-2018《全自动生化分析仪校准规范》确定，以满足临床最低要求为准。

本文建立的干式生化分析仪校准方法，通过实验验证其示值误差、重复性和线性均符合预设的技术指标要求。本文依据JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》对测量结果进行不确定度评定，根据式(1)，主要的不确定度来源包括测量重复性、分辨力和标准物质。其中，测量重复性和标准物质是不确定度的最主要来源，可忽略分辨力对测量结果的影响。同时，在校准前需要对标准物质在室温下进行充分地复溶，尽可能降低标准物质溶液温度与校准温度不同对测量结果的影响，以确保测量结果具有较小的不确定度。在校准ALT示值误差时需考虑P5P的影响，P5P由维生素B6在体内磷酸化而来，是氨基酸代谢中氨基转移酶（转氨酶）和脱羧酶的辅基。血清中转氨酶有全酶和脱辅基酶两种形式，后者无活性，P5P可作为辅基与之结合得到全酶，显示体内转氨酶的真正水平^[24]。由于干式生化分析仪配置固相载体试剂中普遍含有P5P，应根据标准物质证书选择含有P5P的标准值用于干式生化分析仪校准结果分析。

4.   结论

本文通过对干式生化分析仪的工作原理和校准方法进行分析，确定了其主要计量特性指标，确定了具体的校准方法，并进行了实验验证，验证结果符合要求，以此为基础制定了《干式生化分析仪校准规范》，促进了干式生化分析仪量值溯源的规范化和标准化。另外考虑到本文的篇幅有限，仅选择了代表性的仪器型号进行了验证实验示例，未对更多型号的干式生化分析仪进行验证示例。